Dr. Ferran Abat
Tratamientos sin cirugía

Mecanismos Moleculares de la Electrólisis Ecoguiada (USGET)

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MECANISMOS MOLECULARES DE REPARACIÓN MEDIANTE LA TÉCNICA ELECTRÓLISIS ECOGUIADA (USGET) EN LA TENDINOSIS ROTULIANA

Abat F, et al.

© 2013 SECOT. Publicado por Elsevier España, S.L.

 

INTRODUCCIÓN

La tendinosis rotuliana afecta a un número importante de atletas cuyo denominador común es realizar saltos o movimientos balísticos1. Actualmente se considera la tendinosis un proceso degenerativo más que un proceso inflamatorio, y a pesar de que se han descrito múltiples opciones terapéuticas, ninguna se ha establecido como método estándar2,3.

El uso de modelos experimentales basados en la inducción de tendinosis mediante colagenasa (metaloproteinasa capaz de romper los enlaces peptídicos del colágeno), ha sido usado previamente4. Para el estudio experimental de las tendinosis se ha utilizado previamente la valoración de proteínas como el citocromo C, Smac/Diablo, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), su receptor 2 (VEGFR-2) y el factor de transcripción nuclear peroxisoma proliferador activado del receptor gamma (PPAR-γ). El citocromo c es una proteína monomérica capaz de activar las caspasas desencadenantes de las últimas fases de la apoptosis en las tendinopatías5. La Smac/DIABLO es una proteína mitocondrial, cuya liberación al citosol celular induce la apoptosis, presumiblemente siguiendo las mismas rutas de salida que el citocromo C6. El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es una proteína señalizadora implicada en la angiogénesis y vasculogénesis que ha demostrado, in vitro, estimular la división y la migración de células endoteliales7. Su receptor 2 (VEGFR-2) es un receptor tirosin-quinasa que actúa como el mediador más importante de la respuesta angiogénica del VEGF8. Por último, el peroxisoma proliferador activado del receptor gamma (PPAR-γ), de la familia de los factores de transcripción nucleares (superfamilia de receptores esteroideos), ha demostrado producir una disminución de la respuesta inflamatoria9.

La Electrólisis ecoguiada (USGET) produce una ablación electrolítica no termal que induce a una respuesta inflamatoria controlada, permitiendo activar los mecanismos celulares implicados en la fagocitosis y en la regeneración del tejido blando dañado10.

Dado que trabajos recientes han demostrado buenos resultados clínicos con la técnica a estudio11, el objetivo del presente estudio fue investigar mediante técnicas de inmunodetección y electroforesis los mecanismos moleculares de respuesta tisular implicados en el tratamiento con técnica USGET, tras la inducción de tendinosis con colagenasa en ratas Sprague Dawley.

 

MATERIAL Y MÉTODO

Para llevar a cabo el estudio se utilizaron 24 hembra de ratas Sprague Dawley de 7 meses de edad y aproximadamente 300 gramos de peso. El estudio cumplió con los requisitos éticos y fue aprobado por el Comité de Bioética de la Universidad de Medicina (A-1301314899794). Se siguieron las normas del Real Decreto 1201/2005, de 10 de octubre, relativo a la protección de los animales utilizados para experimentación (BOE nº 252. p34367-34391).

Los animales se distribuyeron en cuatro grupos; 6 ratas de control que no recibieron ninguna intervención (grupo Control), 6 ratas inyectadas con colagenasa que no recibieron tratamiento con técnica USGET (grupo colagenasa), 6 ratas inyectadas con colagenasa y tratadas con técnica USGET a 3 miliamperios (mA) de intensidad (Grupo USGET-3mA), 6 ratas inyectadas con colagenasa y tratadas con técnica USGET a 6 mA de intensidad (Grupo USGET-6mA).

La técnica Electrólisis ecoguiada (USGET) consistió en la aplicación ecoguiada a través de una aguja de 0,32 mm de una corriente continua mediante un dispositivo especialmente diseñado y certificado para tal fin.

Modelo experimental

Se inyecto en la zona proximal del tendón rotuliano de las ratas 50 microgramos de colagenasa de tipo I (Laboratorios Sigma – Aldrich), produciendo una tendinosis comprobada por ecografía siguiendo el protocolo definido por la European Society of Musculoskeletal Radiology para el estudio de tendinopatías12.

Para la realización de la técnica USGET, se realizaron tres punciones eco-guiadas de 4 segundos de duración cada una, en la zona proximal del tendón rotuliano de las ratas con una intensidad de 3mA o 6mA dependiendo del grupo a estudio. Tras 7 días las ratas fueron sacrificadas y se extrajo quirúrgicamente una muestra del tendón siguiendo el procedimiento estándar.

Se utilizó el método Lowry13 para determinar la concentración de proteína en la muestra de tejido en rangos de 0,01-1 mg/ml y se analizó las muestras por inmunodetección y espectrofotometría (λ=660 nanómetros). Se analizaron las proteínas, citocromo C, Smac/Diablo, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y su receptor 2 (VEGFR-2). A su vez se estudió el factor de transcripción nuclear peroxisoma proliferador activado del receptor gamma (PPAR-γ). Se validaron los resultados por estudio western blot contra tubulina, expresando los resultados en unidades de densitometría relativas (RDU).

Análisis estadístico

Los resultados se expresan como media ± desviación estándar. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t-test. Se realizó análisis ANOVA para valorar las relaciones entre las variables, así como pruebas Post- Hoc y de Dunnet para comparar los diferentes grupos con el grupo de control y la prueba de Scheffé para comparar todos los grupos entre si. El nivel de significación se fijó en el 5 % (p< 0,05 ) . El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS versión 17 (SPSS Inc , Chicago , Illinois).

 

RESULTADOS

En el estudio del citocromo C mostró niveles elevados de esta proteína en todos los grupos en comparación con el grupo control (p< 0,001). Se encontraron diferencias estadísticamente significativas al comparar el grupo USGET-3mA y el grupo USGET-6mA (p< 0,013), al igual que al compara el grupo USGET-6mA y el grupo colagenasa (p=0,002).

Figura. Histograma del análisis de la proteína citocromo C. Media ± desviación estándar expresadas en unidades de densitometría relativas (RDU). El * determina significación al comparar con el grupo control y # al comparar con el grupo colagenasa.

 

La proteína Smac/Diablo mostró una sobreexpresión de la misma (p< 0,001), detectando diferencias estadísticamente significativas al comparar los dos grupos de tratamiento (USGET-3mA y USGET-6mA) con el grupo colagenasa (p< 0,001).

Figura . Histograma del análisis de la proteína Smac/Diablo. Media ± desviación estándar expresadas en unidades de densitometría relativas (RDU). El * determina significación al comparar con el grupo control y # al comparar con el grupo colagenasa.

 

El análisis del factor de crecimiento endotelial vascularmostró un aumento significativo (p< 0,001) en todos los grupos a estudio. A su vez se detectó un aumento significativo (p< 0,001) del VEGFR-2.

Figura . Histograma del análisis de la proteína VEGF. Media ± desviación estándar expresadas en unidades de densitometría relativas (RDU). El * determina significación al comparar con el grupo control y # al comparar con el grupo colagenasa.

 

Por último la PPAR-γ (figura 5) presentó un aumento significativo en comparación con el grupo control (p< 0,001) presentando diferencias estadísticamente significativas al comparar los grupo USGET-3mA (p= 0,009) y USGET-6mA (p< 0,001) con el grupo colagenasa.

Figura . Histograma del análisis de la proteína PPAR-γ. Media ± desviación estándar expresadas en unidades de densitometría relativas (RDU). El * determina significación al comparar con el grupo control y # al comparar con el grupo colagenasa.

 

DISCUSIÓN

El principal hallazgo de este de trabajo fue que la técnica Electrólisis ecoguiada (USGET) produjo una sobreexpresión de las proteínas citocromo C, Smac/Diablo, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR-2) y del factor de transcripción nuclear peroxisoma proliferador activado del receptor gamma (PPAR-γ).

A pesar de que actualmente no exista un tratamiento para la tendinosis considerado como estándar, se han descrito múltiples técnicas destinadas a tal fin. Entre ellas se encuentra el ejercicio excéntrico, la cirugía (abierta o artroscópica), ondas de choque, esclerosis de las neovascularizaciones, antiinflamatorios no esteroideos o la aplicación de plasma rico en plaquetas o aprotina entre otras2,3.

La técnica Electrólisis ecoguiada (USGET) es una corriente eléctrica no termal que induce a una respuesta regenerativa del tejido dañado10. Por inestabilidad iónica se crea la formación de moléculas de hidróxido de sodio produciendo debajo del electrodo activo o aguja catódica una modificación del pH y aumento de la presión de oxígeno permitiendo la fagocitosis y la activación biológica de la reparación del tendón, que se encontraba alterada por la cronicidad del proceso degenerativo10,11.

Trabajos anteriores con terapia electrolítica como el de Gravente et al.14, demostraron los efectos de estas técnicas en la respuesta inflamatoria. Un metaanálisis de Gardner et al.15 demostró que la estimulación eléctrica en heridas crónicas y úlceras de decúbito producía una curación más rápida. Mientras que Zhao et al.16 observaron como un campo eléctrico aplicado a cultivos de células endoteliales estimulaba la producción de VEGF así como la elongación y migración celular. Resultados que concuerdan con los mostrados en el presente trabajo. Posteriormente Yang et al.17 observaron que la aplicación de corriente directa en tejido blando lesionado, es fundamental en la gestión y migración de células epiteliales en la respuesta de cicatrización.

La teoría de la lesión tendinosa secundaria al sobreuso parece ser la más aceptada1. Al igual que autores como Aldredson18 o Tan19, consideramos la tendinosis como un proceso degenerativo más que un proceso inflamatorio. De acuerdo con Fu et al.20 el aumento de la proteína VEGF, Smac / DIABLO, citocromo C, VEGFR-2 y la proteína anti-inflamatoria PPAR-γ está relacionado con la respuesta inflamatoria y reparación tisular. Dado que la tendinosis es un proceso degenerativo el tratamiento con la técnica USGET podría estar justificado10,11,21-23.

El presente estudio mostró una mayor capacidad de sobreexpresión del citocromo C, marcador de apoptosis relacionado con las tendinosis5, tras la aplicación de la técnica USGET. La proteína Smac/Diablo es exportada al citosol desde la mitocondria produciendo apoptosis a través de la activación de caspasas6 y daño en el ADN como resultado de la unión al receptor CD9524. Los datos presentados muestra como los grupos que recibieron tratamiento con la técnica USGET presentaron un aumento de la expresión de esta proteína. Tal y como describió Huang et al.25, el aumento de la apoptosis vía las proteínas Smac / DIABLO y la inducción de VEGF a través de VEGFR-2 , es probablemente debido al aumento de la inhibición de las células B en el desarrollo de la médula ósea y de la diferenciación de las células T del timo.

Tras el tratamiento con la técnica USGET se ha observado un aumento de las proteínas anti-inflamatorias como la PPAR-γ9, donde tiene un papel primordial en la inhibición de la expresión de moléculas pro-inflamatorias secretadas por los macrófagos como el TNF-α, IL-6 e IL-1β26, produciendo una respuesta molecular en el tejido tratado altamente beneficiosa en el transcurso de una tendinosis. A su vez, esto resulta en un aumento de la expresión del VEGF y VEGFR-2, mediadores responsables de la angiogénesis y respuesta anti-inflamatoria7,27. La literatura identifica los receptores VEGFR-1 y VEGFR-2 como los mayor expresados en el tendón Aquiles humano8. Nuestros resultados muestran un aumento del VEGFR-2 tras el tratamiento con técnica USGET, lo que sugiere una modificación en la vía de apoptosis celular y un aumento de la angiogénesis.

Una limitación de este estudio fue el uso de modelos experimentales en animales, por lo que los resultados obtenidos podrían no ser completamente extrapolables en humanos28. Sin embargo, los resultados de este estudio son alentadores y ponen de relieve la necesidad de realizar estudios adicionales que incluyan microdiálisis molecular y estudio histológico del tejido tratado18,29. Se debe destacar el moderado número de animales de experimentación, si bien los resultados han demostrado una adecuada potencia estadística. Otra limitación podría ser el estudio de seis alteraciones moleculares en una patología tan compleja y desconocida como la que se presenta.

CONCLUSIONES :

La técnica Electrólisis ecoguiada (USGET) produce, en la lesión tendinosa inducida con colagenasa tipo I en ratas, un aumento de los mecanismos moleculares anti-inflamatorios y angiogénicos.

 

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